In der molekularen Diagnostik werden momentan hauptsächlich Short Read Sequenzierer von den Firmen Illumina bzw. Thermo Fisher eingesetzt weil ihre Technologie sehr verlässlich ist und weniger Fehler produziert als die nächste Generation der Long Read Sequenzierer (PacBio, Oxford Nanopore). Der Nachteil der Short Read Sequenzierungen ist, dass die Vorbereitung relativ aufwendig ist.
Bei der Vorbereitung der Probe, auch "library preparation" genannt, sind mehrere Schritte für eine erfolgreiche Sequenzierung nötig und um qualitativ gute Ergebnisse zu erhalten sollte die library preparation sorgsam und unter höchsten Standards gemacht werden. Folgende Schritte werden benötigt:
- DNA / RNA Extraktion
- Fragmentierung durch enzymatische oder mechanische Mittel
- Endreparatur und Prozessierung zur Homogenisierung der heterogenen Fragmentenden. (DNA repair and end-polishing (blunt-end or A-overhang)
- Adapterligation zur “Clustererzeugung” und klonalen Amplifikation in der Zelle.
- Größenauswahl zum Entfernen suboptimaler Fragmentgrößen und Adapterdimere.
Warum brauchen wir eine Größenauswahl ?
- Illumina und Ion Torrent Geräte sind meist für 200–500 bp Fragmente optimiert.
- Fragmente kleiner als 150 bp stören die Auswertung -> Adaptoren, Primer Dimere
- Ab einer Länge von 500 bp ist die Sequenzierung ineffizient und fehleranfällig
–> ein Problem, das Sequenzierer der dritten Generation zu lösen versuchen.
Welche Methoden zur Grössenauswahl gibt es ?
Enzymatisch
z.B Nextera Kits von Illumina. Benutzen Transposons zur Fragmentierung. Ergebnisse aber oft unzufriedenstelllend (Breite Grössenverteilung)
Gel Elektrophorese
Sehr genaue Methode aber extrem aufwendig und zeitintensiv
Magnetic bead – Technologie
DNA-Fragmente der gewünschten Größe binden in Gegenwart des optimierten Puffers an die Beads. Ein Magnet wird verwendet, um die Beads/DNA zu befestigen Kostengünstig, weniger zeitaufwendig als Gel Elektrophorese, gute Qualität
RBC hat den ersten vollautomatischen Grössenauswahlkit entwickelt. Der Kit ist kompatibel mit allen aktuellen MagCore Vollautomaten (z.B. Super, Plus II) und basiert auf der Magnetic Bead Technologie
Eigenschaften:
1. Automatische DNA Aufreinigung und Grössenselektion in ~ 30min
2. "magnetic bead" Technologie
3. Hohe Ausbeute
4. Wenig Arbeitszeit
5. Konstant gute Qualität – keine manuellen Fehler
Anwendungen:
1. DNA library peparation für NGS
2. Aufreingungen für PCR, Hybridisierungen oder Real-Time PCR
