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In der molekularen Diagnostik werden momentan hauptsächlich Short Read Sequenzierer von den Firmen Illumina bzw. Thermo Fisher eingesetzt weil ihre Technologie sehr verlässlich ist und weniger Fehler produziert als die nächste Generation der Long Read Sequenzierer (PacBio, Oxford Nanopore). Der Nachteil der Short Read Sequenzierungen ist, dass die Vorbereitung relativ aufwendig ist.

Bei der Vorbereitung der Probe, auch "library preparation" genannt, sind mehrere Schritte für eine erfolgreiche Sequenzierung nötig und um qualitativ gute Ergebnisse zu erhalten sollte die library preparation sorgsam und unter höchsten Standards gemacht werden. Folgende Schritte werden benötigt:

  1. DNA / RNA Extraktion
  2. Fragmentierung durch enzymatische oder mechanische Mittel
  3. Endreparatur und Prozessierung zur Homogenisierung der heterogenen Fragmentenden. (DNA repair and end-polishing (blunt-end or A-overhang)
  4. Adapterligation zur “Clustererzeugung” und klonalen Amplifikation in der Zelle.
  5. Größenauswahl zum Entfernen suboptimaler Fragmentgrößen und Adapterdimere.

Warum brauchen wir eine Größenauswahl ?

  • Illumina und Ion Torrent Geräte sind meist für 200–500 bp Fragmente optimiert.
  • Fragmente kleiner als 150 bp stören die Auswertung -> Adaptoren, Primer Dimere
  • Ab einer Länge von 500 bp ist die Sequenzierung ineffizient und fehleranfällig

  –> ein Problem, das Sequenzierer der dritten Generation zu lösen versuchen.


Welche Methoden zur Grössenauswahl gibt es ?

Enzymatisch

z.B Nextera Kits von Illumina. Benutzen Transposons zur Fragmentierung. Ergebnisse aber oft unzufriedenstelllend (Breite Grössenverteilung)

Gel Elektrophorese

Sehr genaue Methode aber extrem aufwendig und zeitintensiv

Magnetic bead – Technologie

DNA-Fragmente der gewünschten Größe binden in Gegenwart des optimierten Puffers an die Beads. Ein Magnet wird verwendet, um die Beads/DNA zu befestigen Kostengünstig, weniger zeitaufwendig als Gel Elektrophorese, gute Qualität


RBC hat den ersten vollautomatischen Grössenauswahlkit entwickelt. Der Kit ist kompatibel mit allen aktuellen MagCore Vollautomaten (z.B. Super, Plus II) und basiert auf der Magnetic Bead Technologie

Eigenschaften:

1. Automatische DNA Aufreinigung und Grössenselektion in ~ 30min

2. "magnetic bead" Technologie

3. Hohe Ausbeute

4. Wenig Arbeitszeit

5. Konstant gute Qualität – keine manuellen Fehler

Anwendungen:

1. DNA library peparation für NGS

2. Aufreingungen für PCR, Hybridisierungen oder Real-Time PCR

Digitale PCR ist eine spezielle Weiterentwicklung der klassischen PCR. Das Besondere an dieser PCR Anwendung ist, dass einzelne DNA Moleküle in winzigste Kompartimente getrennt werden, sodass jeweils nur 1 Strang oder keiner in einem Kompartiment amplifiziert wird. Die Art der Aufteilung hängt von der Technologie ab – es wird grob zwischen digital droplet PCR und chamber digital PCR  unterschieden. In einem Fall (ddPCR) werden kleinste Öl-Tropfen getrennt und in dem anderem Fall Moleküle in kleinste Mikrobereiche aufgeteilt (cdPCR).

Digitale PCR besticht durch hohe Sensitivität und Spezifität und durch die hohe Verdünnung ist die Beeinträchtigiung durch PCR Inhibitoren fast ausgeschlossen.

Wir sind immer an innovativen Produkten interessiert und können jetzt auch erstmals ein Produkt basierend auf dPCR anbieten.

Die Quantifizierung von BCR-ABL1 bzw. ABL1 aus Vollblut von Patienten mit positiver chronischer myeloischer Leukämie (CML) ist sehr gut geeignet für digitale PCR. Der Dr. PCR™ BCR-ABL1 Major IS Detection Kit ist ein in-vitro-Diagnose Kit und soll das Verhältnis von BCR-ABL1 zu ABL1 messen. Der Kit erlaubt eine akkurate Beobachtung von Leukämie Patienten während einer Therapie bezüglich Verhältnis BCR ABL1 - ABL1 Transkripte.  

Der Kit besteht aus 1 Tube dRT-PCR Master Mix und 1 Tube Primer & Probe Mix. Die beiden Reagentien werden in einem Reaktionsgefäß mit dem RNA Extrakt zusammengemischt und in eine mitgelieferte Kartusche injiziert. In der Kartusche wird die Probe in 22000 Kompartimente (50nm) verteilt. Diese Kartusche wird in das real-time Gerät plaziert und nach der qPCR wird das Ergebnis ausgegeben.

Fakten

  • 1,5 h bis zum Ergebnis ausgehend von RNA Extrakten
  • Zielregion für BCR-ABL1: e13a2, e14a2
  • Absolute Quantifizierung ohne Standardkurve
  • 1 oder 16 Proben gleichzeitig (je nach Gerät)

Ringversuche dienen dazu, die Leistungsfähigkeit eines Labors und ihres Testsystems zu überprüfen. Wenn man medizinische Proben analysiert, muss man sichergehen, dass die Testergebnisse stimmen. Bei Ringversuchen werden identische Proben an teilnehmende Labore verschickt. Es gibt verschiedenste Einflussfaktoren, die die Testergebnisse beeinflussen, wie zum Beispiel die Laborausstattung, die Arbeitsweise der Mitarbeiter und natürlich das Testsystem. Die Testergebnisse werden vom Ringversuch-Anbieter gesammelt und statistisch verarbeitet, um die Messgenauigkeit der Labore zu bewerten

Wir von BioProducts überprüfen unsere Testsysteme mittels Ringversuchen um den Kunden zuverlässige Analysen zu  garantieren.

Im Jahr 2022 konnten wir bisher nachweisen, dass unsere HPV Testsysteme den Qualitätsstandards entsprechen. Beim HPV Zervixkarzinom Ringversuch haben wir mit unserem Extraktionssystem von RBC (MagCore® Genomic DNA FFPE One-Step Kit) und dem Panelsystem von Ausdiagnostics (High-Risk HPV Genotyping 8-well (Ref 23201) erfolgreich teilgenommen. Der molekularbiologische Nachweis zur Identifizierung und Unterscheidung der HPV Typen wird immer wichtiger zur Früherkennung von Krebserkrankungen. Es gibt mittlerweile mehr als 120 bekannte HPV Typen und PCR Tests können zuverlässig unterscheiden ob es sich um einen „High Risk“ oder „Low Risk“ Typ handelt. Infektionen mit Hochrisiko-HPV-Typen können zu Tumoren (z. B. Gebärmutterhalskrebs bei HPV16/HPV18)  führen, während Niedrigrisiko-HPV-Typen ( z.B. HPV6 und HPV11) für Genitalwarzen verantwortlich sein können.

Weiters überprüfen wir regelmäßig die Qualität unserer SARS Cov-2 Testsysteme bei den ÖQUASTA (Österreichische Gesellschaft für Qualitätssicherung und Standardisierung medizinisch-diagnostischer Untersuchungen) Rundversuchen. Sowohl unser POC Analysegerät (LR 1000) als auch das respiratorische Panel (SARS-CoV-2, Influenza & RSV 8-well) von Ausdiagnostics haben 100% der Proben beim letzten Rundversuch (7; August 2022) richtig analysiert. Das gelang nur 73% aller Teilnehmer.

Am 29.09. und 30.09. September 2022 findet die 21. ÖGH (Österreichiche Gesellschaft für Humangenetik) Jahrestagung im Zentrum von Graz statt.

Die ÖGH Jahrestagung ist die  wichtigste wissenschaftliche Veranstaltung im Bereich der Humangenetik in Österreich. Die österreichischen Humangenetik-Institute präsentieren die neuesten Trends in der Forschung und Entwicklung mit Schwerpunkt Genom-Diagnostik. Führende Experten werden bei dem Treffen diagnostische Möglichkeiten und Probleme, die die neuesten Technologien in der Genomforschung bringen, diskutieren

Lernen sie die neuesten Errungenschaften in der Humangenetik-Forschung und Diagnostik kennen und besuchen sie in den Pausen unseren Stand. Wir stehen zur Verfügung um mit Ihnen über aktuelle Trends in der Diagnostik zu sprechen und wir bemühen uns Lösungen für offene Fragestellugen anzubieten.

Themen:

Genomsequenzierung, Single-Cell Analysen, Mutationsanalysen, Epigenetik, Tumor und cfDNA, ctDNA und vieles mehr

Wann und wo ?

29-30. September 2022 Meerscheinschlössl, Graz

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